01 操作步骤

1.1 细胞准备。

  1.1.1 正常冻存的细胞。从液氮中取出，37℃快速融化，5倍完全培养基稀释，混匀15 ml离心管，200 g离心5分钟，弃上清。
  1.1.2 正常培养的细胞。弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，加入胰酶消化液1 ml，室温消化1分钟，加入3 ml间充质干细胞完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，移入15 ml离心管，200 g离心5分钟，弃上清。
1.2 细胞重悬。漩涡震荡使细胞分散，5 ml 缓冲液（含0.5% BSA的DPBS）洗细胞两次，弃上清。细胞以4 ml缓冲液重新悬浮。

1.3 抗体孵育。分别将抗体、同型对照（同型对照抗体混合到1个反应中）5 μl（按照抗体说明书上细胞数对应的抗体量添加）加入离心管中，分别加200 μl/管细胞悬液，漩涡混匀，室温、避光孵育15 分钟。

1.4 上机准备。

  1.4.1 细胞不进行固定处理。加5 ml缓冲液/管，200 g离心5 分钟，弃上清，细胞沉淀以200 μl缓冲液重新悬浮，4 ℃避光，30 分钟内上机检测。

  1.4.2 细胞进行固定处理。加5 ml缓冲液/管，200 g离心5 分钟，弃上清，细胞沉淀以200 μl的1%中性多聚甲醛重新悬浮，4 ℃避光，30 分钟内上机检测。
1.5 上机检测。空白对照、同型对照与目标抗体染色的细胞分别上机，以空白对照和同型对照设定参数，以此参数对样本数据进行采集，收集有效细胞数20000个。
1.6 分析。

02 注意事项2.1 本方法的适用范围。细胞表面标志物的检测。2.2 细胞。理论上细胞只需要保持单个细胞在缓冲体系中的悬浮状态。正在培养的细胞和冻存细胞均可进行检测。实际操作中多使用培养中的细胞进行检测，冻存细胞检测时细胞的离散性更大。2.3 抗体：除了抗体的物种等适用性、抗体所携带的荧光与机器的匹配以外，还需要注意，  2.3.1 抗体对应的抗原是变性的还是正常状态的，如果对应的是固定状态的，则在抗体孵育前可能需要用多聚甲醛进行固定；  2.3.2 需要用到荧光二抗的，抗体配对与待检测物种之间尽量避免相同。2.4  细胞量与抗体量。表面标志最终细胞分析数量一般在10000到30000，以此推算开始每个反应的细胞数最好不低于100000个。在处理过程和检测过程中均会有不同程度的细胞丢失，若是使用二抗则数量还需要增加。抗体的添加量与细胞数相关，一般专用抗体的说明书有相关的描述，按照说明书的要求比例添加。2.5 抗体孵育后的固定。一般抗体孵育后需要进行固定，固定后的数据更稳定。2.6 缓冲液。缓冲液中加入BSA具有一定的非特异结合封闭功能，对细胞也保护作用，建议添加。2.7 离心力。一般细胞培养实验室的水平离心机选择1000 rpm。离心力过大，影响细胞状态，一些细胞碎片等杂质影响检测效果。离心力过小容易细胞丢失。2.8 细胞团块。流式检测需要细胞呈单个悬浮，若有明显的细胞团块，可以用200-300目的细胞滤网过滤后再进行抗体孵育和后续操作。若检测前发现细胞团块，也可以上机前进行细胞滤网过滤，或者直接用小枪头将团块吸出。2.9 细胞碎片处理。若细胞碎片过多，可以采用低速短时离心的方法去除。如800转3分钟，轻轻将上清吸弃。2.10 避免交叉污染。几种抗体同时检测时，避免枪头等可能导致交叉的情况。如弃去液体后避免污染共用操作面，避免加液枪头碰触可能有抗体的离心管口等。
希望能对操作人员有所帮助，能解决实际问题，满足实际需求。 有相关技术问题，请联系弗元生物。 

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