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类器官免疫荧光染色方法

人阅读 发布时间:2024-01-30 14:07

01 冰冻切片法

  1. 将培养好的类器官用巴氏吸管转移到离心管(或EP管),低速短时离心(800rpm以下),让类器官沉到管底;
  2. PBS洗1次;
  3. 加入4%的中性多聚甲醛,室温固定过夜;
  4. PBST洗2次,5分钟每次;
  5. 用巴氏吸管将类器官吸出,用OTC包埋,进行冰冻切片;
  6. 用PBST浸泡切片,去除OTC包埋液;
  7. 在切片位置加0.3%的Triton X100,室温处理40分钟;(组织周围用组化笔画圈)
  8. PBST洗1次,5分钟每次;
  9. 加入5%的BSA(PBST)溶液,室温封闭2小时;
  10. 甩弃封闭液,加一抗,4℃过夜;
  11. 加入PBST洗3次,5分钟每次;
  12. 加二抗,室温避光孵育1-2小时;
  13. PBST洗3次,5分钟每次;
  14. 加入DAPI进行细胞核染色,室温30分钟;
  15. PBST洗1次,5分钟每次;
  16. 加入防荧光淬灭的封片液,荧光显微镜观察。
注:液体加入量根据样本多少自行确定。低速离心,离心力不可过大,也可以用静置自行沉降的方法。
 

02 整体染色法

  1. 将培养好的类器官用巴氏吸管转移到离心管(或EP管),低速短时离心(800rpm以下),让类器官沉到管底;
  2. PBS洗1次;
  3. 加入4%的中性多聚甲醛,室温固定过夜;
  4. PBST洗2次,5分钟每次;
  5. 加0.3%的Triton X100,室温处理1小时;
  6. PBST洗1次,5分钟每次;
  7. 加入5%的BSA(PBST)溶液,室温封闭2小时;
  8. 甩弃封闭液,加一抗,4℃过夜;
  9. 加入PBST洗3次,5分钟每次;
  10. 加二抗,室温避光孵育1-2小时;
  11. PBST洗3次,5分钟每次;
  12. 加入DAPI进行细胞核染色,室温30分钟;
  13. PBST洗2次,5分钟每次;
  14. 用巴氏吸管将类器官移入可用于荧光观察的培养皿,荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。
注:操作过程均在离心管(EP管)内完成。液体加入量根据样本多少自行确定。低速离心,离心力不可过大,也可以用静置自行沉降的方法。 以上方法为基本步骤,详细步骤需要根据各自实验进行细节完善和调整。 有相关技术问题,请联系弗元生物。 

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