01 复苏

材料准备：1、细胞培养室灭菌。2、培养耗材灭菌。培养耗材灭菌后放置合适的位置，如离心管、移液枪头、培养皿、培养板等放置到生物安全柜（或超净工作台）。所需工具放置到合适位置。如移液枪、废液吸引器（或废液缸）放置到生物安全柜（或超净工作台），离心机设置好转速和时间，培养箱状态良好，倒置显微镜准备妥当，水浴锅（或 细胞复苏仪）保证无菌并预热到 37℃。所用试剂进行室温复温 30 分钟。如 MSC 完全培养基、DPBS 等复温并洁净表面后置于生物安全柜（或超净工作台）。特别提醒，将实验过程看熟，并打印后放置于方便核对的位置。

实验步骤

以下步骤包括细胞、培养基等关键操作均在生物安全柜（或超净工作台）中进行。

1、复苏准备。将完全培养基 5ml 置于 15ml 离心管中，做好标记，备用。 2、细胞复苏。将细胞从液氮中取出，快速转入细胞培养室，迅速置于已经准备好的水浴锅，将盖子一下部分浸入水中，轻轻摇动。几乎完全融化时从水浴中取出，75% 酒精喷洒消毒表面后移入生物安全柜（或超净工作台）。打开冻存管，用 1ml 移液器将细胞 悬液移入上述已经添加好培养基的离心管中，轻轻拨动离心管底部（或使用漩涡混匀仪）使细胞充分混匀。3、弃冻存液。拧紧离心管盖子，1000rpm（约 180g）离心 5 分钟，使细胞沉淀到离心管底部。从离心机中取出离心管，移入超净工作台（若担心污染，移入前用 75%酒精喷洒消毒表面），用吸液器轻轻吸除上清（或用移液器吸除）。注意吸液器枪头吸力较大，倾斜离心管，并确保移液头距离细胞大于 0.5cm，避免细胞被丢弃。 4、接种培养。轻轻拨动离心管底（或使用漩涡混匀仪）使细胞分散，加入已经复温的完全培养基 5ml，用 1ml 移液器轻轻吹打 3 次后，将细胞悬液移入 T25 的细胞培养瓶（注意要用 TC 表面等易贴附的培养瓶）。一支细胞复苏至一个 T25 培养瓶，切不可密度过低。左右前后 倾斜摇动培养瓶，使细胞悬液均匀铺满培养瓶底部，以保证细胞接种的均匀。或可以先立起 培养瓶摇动使细胞充分悬浮后迅速放平，立即置于培养箱静置培养。24 小时内不易移动或 取出进行观察。

注意事项：

1、吸液器每次吸液后均更换新鲜移液枪头，避免污染和交叉污染。 

2、培养瓶使用时需注意透气性，若为透气瓶盖需要旋紧，若为密封盖则旋紧后反向 旋松以使能充分进行气体交换。 

3、刚复苏的细胞有个恢复期，增殖比直接传代的稍慢。

4、培养箱条件设置为 37℃、5% CO2、饱和湿度。

02 换液
24 小时后观察细胞。若有较多悬浮细胞，则需要更换新鲜培养基，以去除死亡或状态 不好的细胞。

注意，新加的完全培养基必须室温进行复温，可参考培养基说明书进行操作。轻轻摇动培养瓶，以使未贴壁细胞充分悬浮，但力道不易过大到影响正常细胞。迅速用吸液器完全吸除培养基，并立即加入 5ml 新鲜培养基。（加入培养基是不要直接冲在细胞贴壁的面，可以从侧壁或顶壁加入。）加入培养基是不要直接冲在细胞贴壁的面，可以从侧壁或顶壁加入。盖好培养瓶盖，置于培养箱静置培养。 任何时候若接种后 48 小时细胞未长满，或不进行传代操作，则必须更换新鲜培养基。或者说培养 48 小时必须更换新鲜培养基。培养基更换方式同上。

03 传代

传代条件。细胞增殖到 90%-100%汇合度时进行细胞传代。细胞密度切不可过低，也不 可过大，意思是不能让细胞增殖到出现层叠现象。若判断过夜后细胞密度会过大，则选择进 行细胞传代。细胞密度或汇合度用 4 倍或 10 倍物镜观察，若初学把握不好，可每天拍照记 录。 传代准备。培养基、DPBS、胰蛋白酶进行室温复温 30 分钟以上，使液体温度尽量接近 室温。耗材放置到方便操作的位置，用到的设备准备好。细胞消化。

1、立起培养瓶并适当倾斜，用吸液器吸弃培养上清。

2、加入 3-5 ml DPBS 轻轻摇 动，以充分洗掉细胞表面残余的培养基。用吸液器吸弃 DPBS。再次加入 3-5 ml DPBS，并吸弃。

3、加入 1-2 ml 0.125%的胰蛋白酶-EDTA（若无此浓度，可用 DPBS 稀释 0.25%的胰酶），平放细胞培养瓶并迅速晃动使得消化液均匀分散到细胞表面，并开始计时，同时将培养瓶平放于操作台面。

4、1 分钟，拿起培养瓶使其水平方向用底部猛然另一只手的手掌，迅速观察，此时细胞应绝大部分已经脱壁。迅速加入 3-5 倍体积的完全培养基终止消化，轻轻晃动培养瓶使消化得以完全终止。轻轻吹动细胞，移入离心管。1000rpm 离心 5 分钟。

注意事项：1、细胞吹打对细胞的损伤较大，必须做到轻柔吹打，所有细胞吹打过程均必须避免 出现气泡。应尽量避免用吹打的方式使得牢固贴壁的细胞脱壁。贴壁过牢的细胞选择丢弃。2、胰酶必须室温复温。消化开始前必须准备好终止消化所用的培养基和移液器，以做到用最短的时间进行终止。细胞消化时间不能超过 2 分钟。一般消化 1 分钟内即可达到效 果，若不能达到效果常见的原因有 3 个，培养液有残余、胰酶温度过低、细胞本身问题。3、胰酶终止必须彻底。可使用含有 10%FBS 的培养基按照一比一或更多终止液的比 例进行终止。细胞接种。用吸液器吸弃上清，注意在不吸走细胞的前提下尽量吸净上清。轻轻拨动离 心管底部（或使用漩涡混匀仪）使细胞团尽量分散。加入 3-6 ml 新鲜完全培养基，轻轻吹打 或涡旋混匀，加入 3-6 个新鲜 T25 培养瓶，每瓶加入细胞悬液 1 ml。向培养瓶补加新鲜培基至 5 ml/瓶。立起培养瓶轻轻摇动，使细胞在液体中充分分散混匀，然后放平并轻轻摇动 使均匀铺满底面。置于培养箱进行培养。

注意事项：

1、状态良好的细胞长满 1 个 T25 培养瓶约为 1-2×10^6个细胞，若长满后仍然低于 6 次方，则可能细胞发生老化。传代比例根据传代前细胞密度和数量而定，若细胞并未完全长 满，而判断过夜后会长过满，此时传代比例可以稍低，过细胞密度过大则传代比例也适当加 大。正常细胞接种到新瓶中的数量约为 4-5×10^5个。细胞传代的密度还需自行判断。若细胞 增殖 4-5 天仍未长满则说明传代密度过低。正常情况下 2-3 天传代为比较合适。

2、接种后置于培养箱请务必确认细胞的均匀分布，具体方法可不局限，但力道不宜过大，分布必须均匀。

 其他注意事项可参考培养基说明书。

04 冻存

冻存准备。

准备好冻存管、冻存盒等必备物品，并预先配制细胞冻存液或准备商品化的细胞冻存液。 

冻存液配制。

胎牛血清（FBS）20%、基础培养基 60-65%、二甲基亚砜（DMSO）5-10%。按照 FBS、培养基和 DMSO 的顺序依次加入离心管并充分混匀。加入下一组分前必须保证前 边组分已经充分混匀。FBS 可以用白蛋白、KOSR 等替代。DMSO 浓度大对冻存有较好的保护 作用，但常温有细胞毒性，所以其浓度可根据需要自行确定。 

冻存条件。

细胞冻存必须选择增殖状态良好的细胞。一般增殖正常到传代时的细胞进行冻存。细胞消化收集方式与细胞传代时相同。

冻存。

离心后的细胞悬液，用吸液器吸弃上清。拨动离心管底部（或使用漩涡混匀仪） 是细胞充分分散。加入合适量的细胞冻存液，迅速混匀，分装到准备好的离心管中。程序降温盒或程序降温仪降温至-80℃以下。然后置于液氮长期保存。

注意事项

1、每管细胞冻存量约为新接种 1 个 T25 培养瓶的量，体积约为 500 μl。此密度为 复苏做好准备，以便于复苏后细胞密度较为合适。冻存体积不易过大，过大在复苏时融化较 慢，对细胞有一定伤害。 

2、细胞冻存方式可以选择程序降温或玻璃化冻存。但都对细胞有一定的伤害，这属于正常现象。使用程序降温盒冻存方式在-80℃冰箱过夜后必须移入液氮，-80℃长时间对细 胞活性有影响，甚至导致细胞大量死亡。

3、冻存管建议选择内旋盖。在细胞处理前做好标记，以保证细胞置于冻存液后在尽 量短的时间内进入冻存降温程序

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